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微生物工程菌种  

2008-05-14 20:20:30|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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一、发酵工业对微生物菌种的要求

尽管工业用微生物菌种多种多样,但作为大规模生产,选择菌种应遵循以下原则:

1、能在廉价原料制成的培养基上迅速生长,并形成所需的代谢产物,产量高。

2、可以在易于控制的培养条件下迅速生长和发酵,且所需酶活力高。

3、根据代谢控制的要求,选择单产高的营养缺陷型突变株或调节突变株或野生菌株。

4、选育抗噬菌体能力强的菌株,使其不易感染噬菌体。

5、菌种纯粹,不易变异退化,以保证发酵生产和产品质量的稳定性。

6、菌种不是病原菌,不产生有害的生物活性物质和毒素,以保证安全。

 

二、发酵工业中常用微生物菌种

() 细菌

1、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)

分布广,常存在于枯草、土壤等,一般为腐生菌;制曲时,如果水分含量大,温度较高,就容易造成枯草杆菌迅速繁殖;不仅消耗原料蛋白质和淀粉,而且生成刺眼鼻的氨味,造成曲子发粘发臭,使制曲失败。能产生大量淀粉酶和蛋白酶

2、大肠杆菌 (Escherichia coli)

可利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶在工业上被用来进行谷氨酸的定量分析基因工程的很好材料

3、乳酸杆菌  (Lactobacillus sp.)

革兰氏阳性,无芽孢,厌氧或兼性厌氧

可生产乳酸干酪的成熟、乳脂的酸化和腌菜、泡菜制作。

4、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutyleum)

芽孢卵形,中生或次端生,使芽孢囊膨大成梭状或鼓槌形

专性厌氧

发酵生产丙酮丁醇

5、肠膜状明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides)

G+、微需氧至兼性厌氧,生长需要缬氨酸和谷氨酸

在蔗糖液中形成特征性葡聚糖黏液(20~25ºC促使形成)

可生产葡聚糖;使糖汁变粘而无法加工,为糖厂有害菌

6、醋酸菌 (Acetobacter)

不形成芽孢,G-,好气性

分两群:1)只将乙醇氧化成醋酸

           2)将产生的醋酸继续氧化成CO2和水

可生产醋酸

7、棒状杆菌 (Corynebacterium)

以葡萄糖为原料发酵产生酸,是谷氨酸而后其他氨基酸的高产菌

生产谷氨酸等;如北京棒杆菌AS1.299钝齿棒杆菌AS1.542

8、短杆菌 (Brevibacterium)

氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种,也是酶法合成生产辅酶A的菌种

9、黄单胞菌 (Xanthomonas)

细胞直杆状,G-,无芽孢,极生鞭毛

在含蔗糖的琼脂平板上形成圆形、边缘整齐、粘稠光滑的黄色菌落;液体培养形成黄色粘稠的胶状物——夹膜多糖,其黄色为一种水溶性色素

野油菜黄单胞菌(X. campestris) 可以淀粉生产黄原胶(Xanthan gum)

10、假单胞菌  (Pseudomonas)

能发酵生产维生素B12、丙氨酸、谷氨酸、葡萄糖酸、色素、果胶酶;也能进行类固醇(甾体)转化;有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。

 

(二)放线菌

大多腐生,少数寄生; 产生多种抗生素(60%以上),经济价值大

1、链霉菌属 (Streptomyces )

灰色链霉菌(Streptomyces griseus)  生产链霉素

龟裂链霉菌 (Streptomyces rimosus)

菌落灰白色,表面后期有皱折,呈龟裂状;生产土霉素

金霉素链霉菌 (Streptomyces aureofaciens)

PDA培养基上生长时,基内菌丝产生金黄色色素

生产金霉素

红霉素链霉菌 (Streptomyces erythreus)   产红霉素

2、小单胞菌属 (Micromonospora)

与一般放线菌不同,菌丝体长入培养基内,不形成气生菌丝,而在基内菌丝体上长出 孢子梗,其顶端生一个球形、椭圆形孢子。

菌落致密,与培养基紧密结合在一起,表面凸起,多崎岖,疣状;菌落常为橙黄色、红色、深褐色、黑色和兰色。

多种可产抗生素,如棘孢小单胞菌 M. echinospora)产庆大霉素

3、游动放线菌属 Actinoplanes

一般不形成气生菌丝,孢囊在基内菌丝上形成,孢囊孢子在孢囊内盘卷或呈直线排列;孢子球形,有时端生1-40根鞭毛,能运动。

济南游动放线菌 产创新霉素

4、诺卡氏菌属 (Norcadia)

一般无气丝,基丝培养十几小时形成横隔,并断裂成杆状或球状孢子。

菌落较小,边缘多呈树根毛状。

生产利福霉素、蚊霉素等

5、孢囊链霉菌属 (Streptosporangium)

孢子丝盘卷成球形孢囊,内形成孢囊孢子,孢囊孢子无鞭毛产多霉素、创新霉素

 

(三)酵母菌

1、啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)

根据长与宽的比例,分三组:

第一组    长宽比为1-2; 细胞多为圆形、卵圆形;主要供生产啤酒、白酒和酒精及面包

第二组    长宽比为2; 多供生产葡萄酒、果酒用

第三组    长宽比大于2;  耐高渗透压,供发酵甘蔗糖蜜生产酒精用

 

啤酒酵母在液体培养基中的生长行为有两类:

上面酵母——发酵度较高,不易凝集沉淀,浮于上面

下面酵母——发酵度较低,易凝集沉淀

啤酒酵母的应用非常广,常用于传统的发酵行业,如啤酒、白酒、果酒、酒精、药用酵母、面包制作,故又称酿酒酵母。近年来,利用啤酒酵母提取核酸、麦角固醇、细胞色素C、凝血质和辅酶A等;生产单细胞蛋白(SCP)可食用、药用和作为饲料;它的转化酶可用于转化蔗糖,制造酒心巧克力。

2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)

与酿酒酵母相似,主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵棉子糖和蜜二糖

葡萄汁酵母常用于啤酒酿造的底层发酵,也可食用、药用或作饲料。

3、汉逊酵母 (Hansenula)

此属酵母多能产生乙酸乙酯,从而增加产品的香味,可用于酿酒和食品工业。

由于能利用酒精作碳源,又能在饮料表面产生干皱的菌膜,又是酒精生产的有害菌。

4、球拟酵母 (Toruiopsis)

此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓糖、阿拉伯糖;有的能利用烃类生产蛋白质。

5、假丝酵母 (Candida)

能形成假丝,液体培养时能形成浮膜

可生产SCP、甘油、脂肪酶

6、红酵母 (Rhodotorula)

有明显的红色或黄色色素,很多种因生夹膜而形成粘质状菌落

可由菌体提取大量脂肪、b-胡萝卜素

7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )

又名棉病囊霉,能危害许多重要的经济作物,如棉花、柑橘、番茄等

该菌具有大量合成核黄素的能力,是核黄素生产的重要菌种

8、白地霉 ( Geotrichum candidum )

裂殖,节孢子单个或连接成链

白地霉菌体蛋白营养价值很高,可供食用和饲料用,也可用来提取核酸,在废料废水的利用上很用价值

9、毕赤氏酵母  ( Pichia )

能利用石油或农副产品及工业废料产生菌体蛋白,有些菌株能生产麦角固醇、苹果酸、磷酸甘露聚糖

近年来其在基因工程中的作用日益得到重视

 

(四)霉菌

1、根霉  (Rhizopus)

米根霉 ( Rhizopus oryzae )

淀粉酶活力极强,多作糖化酶使用;又由于具有较强的蛋白质分解能力,也可用于制造腐乳。

华根霉 ( Rhizopus chinentis )

是酿酒所必须的重要霉菌,也是酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌种。

2、毛霉 ( Mucor )

鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus )

从我国小曲中分离出来;

能糖化淀粉且能生成少量酒精;

能产生蛋白酶,有分解大豆蛋白的能力,常用来制作腐乳

总状毛霉 ( Mucor racemosus )

是毛霉中分布最广的一种,几乎在各地土壤中、一些生霉的材料上、空气中都能找到;酒曲中常见;可制作豆豉。

3、曲霉 ( Aspergillus )

米曲霉 ( Aspergillus oryzae )

有较强的蛋白分解能力,同时又具有糖化能力

酿酒中的糖化菌;蛋白酶和淀粉酶的生产菌

黑曲霉 ( Aspergillus niger )

具有多种强大的酶系,如淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶和葡萄糖氧化酶等;

还能产生多种有机酸,如抗坏血酸、柠檬酸、葡萄糖酸和没食子酸等;

生产柠檬酸和葡萄糖酸的重要菌种。

4、青霉 ( Penicillum )

产黄青霉 ( Penicillum chrysogenum )

生产青霉素,也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸

娄地青霉 ( Penicillum roqueforti )

属不对称青霉组,具有分解油脂和蛋白质的能力,可用于制造干酪;该菌孢子能将甘油三酯氧化为甲基酮

展开青霉 ( P. patulum )

又名寻麻青霉,主要用于生产灰黄霉素(一种有效的可口服抗生素,用于治疗真菌性皮肤病、痢疾及灰指甲)

橘青霉 ( P. citrinum ) :

许多菌系可产生橘霉素,也能产生脂肪酶、葡萄糖氧化酶和凝乳酶;

有的菌系产生5`-磷酸二酯酶,可用它生产5`-核苷酸

 

第二节  菌种来源

一、菌种分离与筛选工作程序

分离与筛选菌种的具体做法一般分4个步骤:

样品采集增殖培养→纯种分离→生产性能测定

二、分离与筛选的设计要求

在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标:

1、菌的营养特征   一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰富的原料

2、菌的生长温度

3、菌的稳定性

4、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度

5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性

6、容易从培养液中回收产物

(3-6是用来衡量菌种的生产性能,如能满足这几条,便有希望成为效益高的生产菌株)

三、含微生物样品的采集

应根据分离目的灵活掌握

极端环境

根据微生物的营养类型采样

根据微生物的生理特性采样

四、含微生物样品的富集培养

富集(enrichment)培养

在目的微生物含量较少时,根据微生物的生理特点,设计一种选择性培养基,创造有利的生长条件,使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖,数量增加,由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种,以利分离到所需的菌株。

其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件,例如,供给特殊的基质或加入某些抑制剂。

控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开;

高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开;

控制pH可分离嗜酸或嗜碱微生物;

高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物;

在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性

五、利用固体平板的生化反应进行分离 (方法之一)

利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初步分离的方法。

分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。

可显著提高分离效率

透明圈法、变色圈法、 生长圈法、抑菌圈法

1、透明圈法:

在平板培养基中加入溶解性较差的底物,使培养基混浊;

能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈,圈的大小初步反应菌株利用底物的能力

分离水解酶产生菌时较多采用,如蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等;

例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌:土壤经巴氏消毒,以减少不产芽孢的微生物;然后铺在pH8-9的琼脂培养基(含有均匀的不溶性蛋白质)表面;碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质,产生一透明圈。

2、变色圈法

对于一些不易产生透明圈产物的产生菌,可在底物平板中加入指示剂或显色剂,使目的微生物菌落周围呈现变色圈,从而能被快速鉴别出来。

如筛选果胶酶产生菌:用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板,对含微生物样品进行分离,待菌落长成后,加入0.2%刚果红溶液染色4h,具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。

3生长圈法

 

通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌;

工具菌(指示菌)是一些相对应的营养缺陷型菌株;

将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养,若某菌株能合成平板所需的营养物,在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。

如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板,在其上涂布含菌样品保温培养,周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌。

4、抑菌圈法

常用于抗生素产生菌的分离筛选

工具菌采用抗生素的敏感菌

六、随机分离方法

七、一些生物活性物质产生菌的分离

1、抗生素产生菌的分离

抑菌圈法、扩散法、生物自显影法等

试验菌的选择是关键(关系到灵敏度、活性、抗菌谱等)

采用专一性强的筛选技术也是检出新抗生素的有效方法

主要是利用抗生素作用机制相关的酶、酶抑制剂、激活剂等建立的筛选技术。

2、抗肿瘤药物产生菌的分离

临床上有效的抗肿瘤药物大多是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质

大部分具有抗菌或抗真菌的活性

生化诱导分析法(Biological induction analysis; BIA

E.coli lacZ 连接在l噬菌体的PL启动子下,当DNA损伤时,诱发l阻遏蛋白CI分解,PL启动子启动lacZ 基因转录,表达出b-半乳糖苷酶;测定b-半乳糖苷酶活性,可检测能损伤DNA的抗肿瘤药物的存在。

3、酶抑制剂产生菌的分离

4、生长因子产生菌的分离

 

第三节  菌种选育

自然选育、诱变育种、杂交育种(有性、准性)、原生质体融合育种、基因工程育种

一、自然选育

在生产过程中,不经过人工处理,利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育。

自然选育的一般程序:制备单孢子(单细胞)悬液→适当稀释→在固体平板上分离→挑取部分单菌落进行生产能力测定→经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株

自然选育的优缺点:自然选育简单易行,可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量等目的。自然选育的最大缺点是效率低、进展慢,很难使生产水平大幅度提高。

 

二、诱变育种

诱变育种就是人为地利用物理或化学等因素,使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化,引起突变,并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。

1、出发菌株的选择

选择时注意以下几点:

1)选择对诱变剂敏感性强、变异幅度大的菌株作为出发菌株。

2)最好选用已经过生产选育的自发突变菌株。

3)采用具有有利性状的菌株作为亲本,如生长速度快,营养要求低等。

4)由于有些菌株在发生某一变异后会对其它诱变因素的敏感性提高,故有时可考虑选择已发生其它变异的菌株作为出发菌株。

2、单细胞(或单孢子)悬液制备

一般均采用生理状态一致的单细胞或单孢子悬液进行诱变处理。

因为:1)分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂;

2)可避免长出不纯的菌落。

若在处理前细胞进行前培养,则变异率可大大提高

3、诱变剂及使用剂量的选择

凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素,统称诱变剂。

物理诱变剂:如紫外线、X-射线、g-射线、快中子、超声波等

化学诱变剂:硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍 (NTG)、亚硝酸(NA)、氮芥(NM)、羟胺、ICR类等

紫外线(Uv)最有效的波长是260nm左右作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性,造成菌体变异甚至死亡

快中子:中子不直接产生电离,但能使吸收中子的物质的原子核射出质子,因而快中子的生物学效应几乎完全是由质子造成的。

氮芥:氮芥为极易挥发的油状物,它的烟酸盐是白色粉末,一般使用的是其烟酸盐。

亚硝酸:常用的有效诱变剂,其诱变作用主要是脱去碱基中的氨基。

亚硝基胍 (NTG)是亚硝基烷基类化合物,可诱发营养缺陷型突变。

剂量:

确定诱变剂后,诱变剂剂量的选择也是育种工作的一个关键问题

对一般微生物而言,诱变率往往随诱变剂剂量的增高而增高,但达到一定程度后,再提高剂量,反而会使诱变率下降。

处理方法:

单一诱变剂处理

复合处理

1)两种或多种诱变剂先后使用

2)同一诱变剂重复处理

3)两种或多种诱变剂同时使用

4、诱变处理后的后培养

表型迟延现象生理性、分离性

初筛

要求迅速地从大量菌株中挑选出较好的一些菌,主要应着眼于尽量扩大挑选范围。

在初筛过程中,一般采用观察初筛菌落在平板上的生理效应所呈现的变色圈、透明圈、生长圈或抑菌圈的大小来进行初步测定。

复筛

在初筛缩小了的范围中选出产量最高的1-2个菌株,主要着眼于在接近生产条件的情况下精确地测定出菌株的生产性状。

复筛一般是将初筛所得到的菌株接种到三角瓶中做摇瓶培养,然后对其培养液进行定量分析测试。

1)营养缺陷型菌株的筛选

2)抗性突变株的筛选

3)温度敏感突变型筛选

TS突变株 temperature-sensitive mutant

在许可温度下能正常生长,其表型和野生型没有区别;在非许可温度下不能生长或微弱生长,表性与野生型不同。

主要由必须基因的突变导致某些基因产物(某种酶)的结构发生改变而引起;

TS突变株在代谢过程中的各个环节,如核酸合成、蛋白质合成、细胞膜或细胞分裂过程中,某种酶的合成或功能都由温度所控制;

根据菌落生长情况,可分两大类:

非必需基因突变形成的温度敏感突变株

在许可温度下的基本培养基上生长,非许可温度的基本培养基上不生长而在完全培养基上生长。是一类突变引起失去单一酶但可以补偿功能的TS突变株。

必需基因突变引起TS突变株

在许可温度的基本培养基上生长,而非许可温度的基本培养基和完全培养基上都不生长;在许可与非许可温度下基本培养基和完全培养基上全部生长,则为野生型菌株。

4、抗反馈调节突变株的筛选

通常抗反馈抑制和抗反馈阻遏突变株是通过抗结构类似物突变的方法筛选出来的;结构类似物与末端产物结构相似,能与阻遏蛋白或变构酶结合,阻止产物的合成,引起反馈调节作用;但不能代替末端产物参与生物合成。抗结构类似物突变株即使在结构类似物存在下,仍可合成末端产物。

5、组成型突变株的筛选

筛选原则:

设计某种有利于组成型菌株生长,并限制诱导型菌株生长的培养条件,造成组成型菌株生长优势或适当的分辨两类菌落的方法,选出组成型突变株。

例如,可在培养基中加入抑制诱导酶合成的物质,使组成型菌株处于选择优势

b-半乳糖苷酶为例:含有乳糖的培养基中加入抑制物邻硝基-b-D-岩藻糖苷——→b-半乳糖苷酶的合成被抑制,因此诱导型菌株不能利用乳糖,故不能生长而组成型菌株能合成该酶,利用乳糖生长,使组成型菌株被富集。

通过显色反应可在平板上识别组成型菌株。

 

三、杂交育种

一)细菌杂交育种

转导、转化、接合

二)放线菌杂交育种

放线菌和细菌一样属于原核微生物,但却象霉菌那样以菌丝形态生长,且形成分生孢子,所以就本质来说,放线菌的基因重组过程近似于细菌,但就育种方法来说,却有许多与霉菌相似的方面。

1、放线菌杂交原理

放线菌杂交在原理上基本类似于大肠杆菌,通过供体向受体转移部分染色体,经过遗传物质交换,最终达到基因重组。

部分放线菌在杂交过程中会形成异核体,但这种异核体与霉菌异核体不同,在复制过程中染色体不发生交换;在基本培养基上表现为形成的菌落都是原养型,当它们产生的分生孢子进一步培养时,形成的菌落却都属于两亲本类型。

另一部分放线菌杂交过程不形成异核体,真正类似于大肠杆菌杂交,两个不同基因型的菌株通过接合,细胞间沟通,供体菌株的部分染色体转移到受体菌细胞中,染色体发生交换,最后达到重组,获得各种重组体。

在放线菌杂交重组过程中,异核体的作用不大。只有经部分染色体转移途径形成的部分结合子,才是亲本间遗传信息传递和基因重组的关键。

放线菌的杂交只发生在具有一定感受态菌株之间。放线菌中也存在类似于大肠杆菌 F因子的质粒,如天蓝色链霉菌中的SCP1因子。当菌丝内存在SCP1因子时才能使两亲本菌丝之间发生接合,把供体菌株的部分染色体转移到受体菌中。

2、放线菌杂交过程

1)接合

由两个基因型不同的直接亲本菌丝体混合培养,体细胞间接触和融合,使两个遗传类型不一致的细胞核,在双方细胞增殖过程中部分染色体进行转移和遗传信息交换。

部分结合子是由一个供体细胞的部分染色体和一个受体细胞整套染色体相结合,同时存在于一个细胞中。也有时两个亲本细胞的染色体都是以部分染色体进行结合。

2) 杂合系(heteroclone)和重组体杂合系

部分结合子形成后,在繁殖复制过程中,两种不同基因型的染色体进行一次交换,产生了杂合系;交换后的染色体不是封闭的环状结构而是呈线状,且在染色体末端具有串联的重复体。这种重复结构,有的成为一个二体区,有的是两个二体区。在复制过程中,开口的环状染色体上基因再一次交换,由于位置不同而成为杂合状态,产生了各种不同基因型的重组杂合系。

杂合系是由基内菌丝长出的,形成的菌落很小,能在选择培养基和基本培养基生长。由杂合系上产生的分生孢子绝大多数都是属于双亲本分离子,重组体的数量极少。

3) 重组体

杂合系或重组杂合系,在以后进一步繁殖过程中,杂合状态染色体的不同区段还要进行几次交换。根据交换的位置不同,所携带的基因种类、数量也不一致,形成了一系列基因型的环状染色体细胞,从产生的菌落中可检出不同类型重组分离子。杂合系是形成重组体所必须的阶段。

3、放线菌杂交技术

1)混合培养法

2)玻璃纸法

三)酵母菌杂交育种

霉菌杂交育种

有性杂交 (如根霉)

准性杂交  (如构巢曲霉、青霉等)

杂交方法:

混合培养法斜面衔接法有限液体静止培养法有限固体平板培养法

 

四、原生质体融合育种

一)原生质体融合的概念

就是把两个亲本的细胞分别去掉细胞壁,获得原生质体,将两亲本的原生质体在高渗条件下混合,由聚乙二醇(PEG)作为助融剂,使它们互相凝集,发生细胞质融合,接着两亲本基因组有接触到交换,从而实现遗传重组。

二)原生质体融合育种的优点

1、大幅度提高亲本之间重组频率。原生质体剥离了细胞壁,去除了细胞间物质交换的主要障碍,也避免了修复系统的制约;再加上促融剂的诱导作用,重组频率显著提高。

2、扩大重组的亲本范围。如天蓝色链霉菌的种内重组频率可达20%去除了细胞壁的障碍,亲株基因组直接融合、交换,实现重组,不需要有已知的遗传系统。

3、原生质体融合时亲本整套染色体参与交换,遗传物质转移和重组性状较多,集中双亲优良性状机会更大。

4、可以和其它育种方法相结合,把由其他方法得到的优良形状通过原生质体融合再组合到一个单株中。

三)一般步骤

直接亲本及其遗传标记选择

双亲本原生质体制备与再生

亲本原生质体诱导融合

融合重组体(融合子)分离

遗传特性分析与测定

(一)直接亲本及其遗传标记的选择

优良性状;所用的亲株均要有一定的遗传标记,以便于选择;

一般以营养缺陷型和抗药性等为标记

(二)原生质体的制备与再生

多用酶解法

细菌、放线菌      溶菌酶

酵母菌            蜗牛酶

霉菌              纤维素酶等

影响原生质体制备的因素:

1、菌体的预处理    EDTA(乙二胺四乙酸)、甘氨酸、青霉素、D-环丝氨酸等

2、菌体的培养时间  一般选择对数期后期的菌体进行酶处理

3、酶浓度 

一般来说,酶浓度增加,原生质体的形成率增大;超过一定范围,则原生质体形成率提高不明显;酶浓度过高,往往导致原生质体再生率降低

 建议以使原生质体形成率和再生率的乘积达到最大时的酶浓度作为最适酶浓度。

4、酶解温度   温度对酶解作用有双重影响; 一般2040

5、酶解时间 

6、渗透压稳定剂

(三)亲本原生质体融合(和再生)

促融剂常用 聚乙二醇 (polyethyleneglycol; PEG) 4000 6000PEG可使原生质体的膜电位下降,然后原生质体通过Ca2+交换而促进凝集;PEG渗透压的脱水作用,扰乱了分散在原生质体膜表面的蛋白质和脂质的排列,提高了脂质胶粒的流动性,从而促进了原生质体的相互融合。

电场诱导也可促进原生质体融合

(四)融合子的检出

在选择培养基上检出;如利用营养缺陷型为遗传标记,可在基本培养基上筛选。

原生质体融合后会产生两种情况

一是真正的融合,即产生杂合二倍体或单倍重组体;

二是暂时的融合,形成异核体。

两者均可在选择培养基上生长,一般前者较稳定,后者不稳定,会分离成亲本类型,有的甚至可以异核状态移接几代。因此要获得真正的融合子,必须在融合体再生后,进行几次自然分离选择,才能确定。

 

四)原生质体融合技术在微生物育种中的应用

已得到较好的应用,例如:

生二素链霉菌  提高了螺旋霉素产量;酿酒酵母(可利用葡萄糖生产酒精,但不能利用淀粉和糊精)糖化酵母能利用淀粉和糊精,但产酒精能力很差二者融合,获得了可利用淀粉和糊精生产酒精的融合子。

 

五)灭活原生质体融合技术

灭活原生质体融合技术是指采用热、紫外线、电离辐射以及某些生化试剂、抗生素等作为灭活剂来处理单一亲株或双亲株的原生质体,使之失去再生能力,经细胞融合后,由于损伤部位的互补可以形成能再生的融合体。

灭活条件应适当温和一些,以保持细胞DNA的遗传功能和重组能力。

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